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启因生物 ◇ 技术服务

启因生物
应用qPCR探索微生物研究

启因生物位于上海，成立于2013年，专业在微生物研究领域提供qPCR技术服务和相关绝对定量PCR试剂盒。


目前已经合作过上百家科研单位，包括哈工大环境学院，清华大学环境学院，北京大学环境学院，中科院土壤所，上海交大环境学院，同济大学环境学院等，协助发表的文章杂志包括EST,JHM,BT,EP等顶级环境领域学术杂志，方法署名文章已经超过上百篇。



一、检测服务（相对定量及绝对定量）

相对定量：

检测目的基因在样本中的相对比例，通过2-∆∆ct计算。


绝对定量：

检测目的基因在样本中的分子量，即通过构建标准曲线对目的基因进行分子数目的定量。



01
抗性基因qPCR检测服务


①高通量抗性基因qPCR检测

Gene Classificationgene
Aminoglycoside

AAC;AAC(6')I1;AAC(6')-IB-1;AAC(6')-IB-2;AAC(6')-IB-3;AAC(6')-II;AAC(6')-IY;

AACA/APHD;AACC;AACC1;AACC2;AACC4;AADA-01;AADA-02;AADA1;AADA-1-01;

AADA-1-02;AADA2-01;AADA2-02;AADA2-03;AADA5-01;AADA5-02;AADA9-01;AADA9-02;

AADD;AADE;APH;APH(2')-ID-01;APH(2')-ID-02;APH6IA;APHA1;APHA3-01;APHA3-02;SPCN-01;SPCN-02;STR;STRA;STRB

Beta Lactamase

AMPC/BLADHA;AMPC-01;AMPC-02;AMPC-03;AMPC-04;AMPC-05;AMPC-06;

AMPC-07;AMPC-08;AMPC-09;BLA1;BLA-ACC-1;BLACMY;BLACMY2-01;BLACMY2-02;

BLACTX-M-01;BLACTX-M-02;BLACTX-M-03;BLACTX-M-04;BLACTX-M-05;BLACTX-M-06;

BLAGES;BLAIMP-01;BLAIMP-02;BLA-L1;BLAMOX/BLACMY;BLAOCH;BLAOKP;BLAOXA1/BLAOXA30;

BLAOXA10-01;BLAOXA10-02;BLAOXY;BLAPAO;BLAPER;BLAPSE;BLAROB;BLASFO;BLASHV-01;

BLASHV-02;BLATEM;BLATLA;BLAVEB;BLAVIM;BLAZ;CEPA;CFIA;CFXA;CPHA-01;CPHA-02;FOX5;MECA;NDM1;PBP;PBP2X;PBP5;PENA}

FCA

ACRA-01;ACRA-02;ACRA-03;ACRA-04;ACRA-05;ACRB-01;ACRB-02;ACRF;ADEA;CATA1;

CATB3;CFR;CMEA;CMLA1-01;CMLA1-02;CMX(A);EMRB/QACA;FLOR;MEXA;MEXD;MEXE;MEXF;

OPRJ;PMRA;QNRA;YIDY/MDTL-01;YIDY/MDTL-02

MGEs

INTI1;TNPA-01;TNPA-02;TNPA-03;TNPA-04;TNPA-05;TNPA-07

MLSB

CARB;EREA;ERM(34);ERM(35);ERM(36);ERMA;ERMA/ERMTR;ERMB;

ERMC;ERMF;ERMJ/ERMD;ERMK-01;ERMK-02;ERMT-01;ERMT-02;ERMX;ERMY;

LMRA-01;LMRA-02;LNUA-01;LNUA-02;LNUB-01;LNUB-02;LNUC;MATA/MEL;MDTA;

MEFA;MPHA-01;MPHA-02;MPHB;MPHC;MSRA-01;MSRA-02;MSRC-01;MSRC-02;

OLEC;PIKR1;PIKR2;VATB-01;VATB-02;VATC-01;VATC-02;VATD;VATE-01;VATE-02;

VGAA-01;VGAA-02;VGAB-01;VGAB-02;VGB-01;VGB-02;VGBB-01;VGBB-02

other/efflux

CATB8;DFRA1;DFRA12;EREB;FOLA

Sulfonamide

SUL1;SUL2;SULA/FOLP-01;SULA/FOLP-02;SULA/FOLP-03

Tetracycline

TET(32);TET(34);TET(35);TET(36)-01;TET(36)-02;TET(37);TET(38);TETA-01;TETA-02;

TETB-01;TETB-02;TETC-01;TETC-02;TETD-01;TETD-02;TETE;TETG-01;TETG-02;TETH;

TETJ;TETK;TETL-01;TETL-02;TETM-01;TETM-02;TETO-01;TETO-02;TETPA;TETPB-01;

TETPB-02;TETPB-03;TETPB-04;TETPB-05;TETQ;TETR-01;TETR-02;TETR-03;TETS;TETT;TETU-01;TETU-02;TETV;TETW-01;TETX

Vancomycin

VANA;VANB-01;VANB-02;VANC-01;VANC-02;VANC-03;VANC1;VANC2/VANC3;

VAND;VANG;VANHB;VANHD;VANRA-01;VANRA-02;VANRB;VANRC;VANRC4;VANRD;VANSA;

VANSB;VANSC-01;VANSC-02;VANSE;VANTC-01;VANTC-02;VANTE;VANTG;VANWB;VANWG;

VANXA;VANXB;VANXD;VANYB;VANYD-01;VANYD-02


②常规抗性基因qPCR检测

只需提供样品，告知检测的抗性基因名称即可。



02
特定微生物检测服务


中文名称英文名称
肠杆菌科

Enterobacteriaceae

肠球菌属

Enterococcus

大肠杆菌属

Escherichia

放线菌门

Actinobacteria

古菌

Archaea

假单胞菌属

Pseudomonas

金黄色葡萄球菌

Staphylococcus aureus

链球菌属

Streptococcus 

酿酒酵母

Saccharomyces cerevisiae 

乳酸杆菌属Lactobacillus
鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus
双歧杆菌属Bifidobacterium
梭菌属Clostridium
细菌Bacteria
芽孢杆菌Bacillus velezensis
真菌Fungi


03
微生物功能基因检测服务




二、检测样本类型及送样要求 

①样本类型

菌液，菌丝体，土壤，粪便，肠道内容物，食糜，水样（滤膜），空气样本等。


②送样要求

样本类型样本量
菌液≥5ml
菌丝体≥0.5g
土壤≥0.5g
粪便≥0.5g
肠道内容物≥0.5g
食糜≥0.5g
水体

过滤（直径3-4cm滤膜2-3张）

或者12000rpm 离心，进行富集。

空气

用无菌滤膜过滤空气


注：含有致病菌或感染性细菌样品不提供检测。

  送样时使用干冰寄样，保证低温运输。



三、检测方法  

荧光染料(SYBR Green)


一种结合于双链DNA的双螺旋小沟区域的绿色荧光染料。

在游离状态下，SYBR Green 发出微弱的荧光，一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。






四、qPCR实验流程  
























五、结果分析  

1.抗性基因绝对定量PCR


扩增曲线（标准质粒）
















熔解曲线（标准质粒）


























标准曲线计算（示例）


不同稀释度的标准物log10(拷贝数/每微升)CT值
原液(1号)68.135
10-1(2号)511.656
10-2(3号)414.977
10-3(4号)318.398
10-4(5号)221.625
10-5(6号)124.942



























例如：

标准曲线：y=-3.3533x+28.359（X是拷贝数对数值，Y值CT值）


样品名称CT值（Y）X值拷贝数（10^x值）
1202.492768311.0057
2251.001710.03922
330-0.489370.324064


目的基因ct为20：提取样本的称重数据为0.25g，溶解DNA体积为50μl，上机检测时样本的稀释倍数为5倍。

目的基因拷贝数每克：311.0057*50（DNA体积）/0.25（称重数据）*5（稀释倍数）=311005.7



2.高通量抗性基因分析作图


ARGs检出数

ARGs检出统计表
样品名称AminoFCABetaMLSBothersMGEsSulTetVan
A2581513474149
B2161415554165
C2151018344207
D2378153641811
E222620244178



















                                                                      Circos图

























微生物与环境因子分析

RDA分析：
























六、客户文献 

文章信息

一作单位

发表杂志

IF

Wang Q, Zhang Z, Xu G, et al. Pyrolysis of penicillin fermentation residue and sludge to produce biochar: Antibiotic resistance genes destruction and biochar application in the adsorption of penicillin in water[J]. Journal of Hazardous Materials, 2021, 413: 125385.

哈尔滨工业大学

J Hazard Mater

10.588

城市水资源与环境国家重点实验室

Wang M, Ren P, Liu H, et al. Investigating antibiotics, antibiotic resistance genes in soil, groundwater and vegetables in relation to agricultural field-Applicated with lincomycin mycelial residues compost[J]. Science of The Total Environment, 2021, 777: 146066.

青岛科技大学

Sci Total Environ

7.963

环境与安全工程学院

Zhou H, Cao Z, Zhang M, et al. Zero-valent iron enhanced in-situ advanced anaerobic digestion for the removal of antibiotics and antibiotic resistance genes in sewage sludge[J]. Science of The Total Environment, 2021, 754: 142077.

上海科技大学

Sci Total Environ

7.963

环境与建筑学院

Yue Z, Zhang J, Zhou Z, et al. Pollution characteristics of livestock faeces and the key driver of the spread of antibiotic resistance genes[J]. Journal of Hazardous Materials, 2021, 409: 124957.

中国科学院南京土壤研究所

J Hazard Mater

10.588

土壤环境与污染修复重点实验室

Cheng D, Liu Y, Shehata E, et al. In-feed antibiotic use changed the behaviors of oxytetracycline, sulfamerazine, and ciprofloxacin and related antibiotic resistance genes during swine manure composting[J]. Journal of Hazardous Materials, 2021, 402: 123710.

东莞理工大学

J Hazard Mater

10.588

生态环境工程研究中心

Ni B J, Yan X, Dai X, et al. Ferrate effectively removes antibiotic resistance genes from wastewater through combined effect of microbial DNA damage and coagulation[J]. Water research, 2020, 185: 116273.

同济大学

Water research

11.236

环境科学与工程学院

污染控制与资源化利用国重实验室

Liu Y, Cheng D, Xue J, et al. Changes in microbial community structure during pig manure composting and its relationship to the fate of antibiotics and antibiotic resistance genes[J]. Journal of hazardous materials, 2020, 389: 122082.

中国农业科学院

J Hazard Mater

10.588

农业资源与区域规划研究所

Li H, Xu H, Yang Y L, et al. Effects of graphite and Mn ore media on electro-active bacteria enrichment and fate of antibiotic and corresponding resistance gene in up flow microbial fuel cell constructed wetland[J]. Water research, 2019, 165: 114988.

东南大学

Water research

11.236

能源与环境学院

Yang Y, Liu G, Ye C, et al. Bacterial community and climate change implication affected the diversity and abundance of antibiotic resistance genes in wetlands on the Qinghai-Tibetan Plateau[J]. Journal of hazardous materials, 2019, 361: 283-293.

中国科学院武汉植物园

J Hazard Mater

10.588

水生植物与流域生态学重点实验室